Líneas de Investigación

Los radioisótopos (isótopos radiactivos o radionucleidos) son elementos químicos con núcleos atómicos inestables que para alcanzar la estabilidad tienden a emitir una partícula o radiación, fenómeno conocido como radiactividad. Como los isótopos de un mismo elemento se comportan químicamente de igual manera pero difieren en aspectos físicos, si incorporamos un radioisótopo en una molécula, ésta puede ser fácilmente detectable por diferentes técnicas en función del tipo de radiación que emita.

Los radionucleidos pueden emitir radiación, fundamentalmente, de tres tipos: emisión de partículas alfa (núcleos de helio), partículas beta (electrones o positrones) o rayos gamma (radiación electromagnética). Aunque en investigación biomédica se emplean todo tipo de radionucleidos en función del proceso biológico a estudiar, en el ámbito de la Radiofarmacia y Medicina Nuclear, los radionucleidos emisores de radiación gamma son los preferidos en exploraciones diagnósticas (en gammagrafía y en la tomografía por emisión de fotón simple, SPECT) por ser este tipo de radiación electromagnética, sin masa, muy penetrante y menos agresiva que las otras. Los radionucleidos emisores de partículas alfa no se suelen emplear para el marcaje de fármacos, debido a su alto poder ionizante y su baja penetración en tejidos. Los radionucleidos emisores de partículas ß, en concreto aquellos que emiten positrones (partículas ß+, con la misma masa del electrón pero con carga positiva) se emplean en diagnóstico (tomografía por emisión de positrones, PET), y los que emiten electrones (partículas ß-) en terapéutica.

Un tomógrafo PET está diseñado para detectar la radiación electromagnética de los dos fotones gamma de 511 KeV emitidos simultáneamente en la misma dirección y en sentido opuesto procedentes de la aniquilación de un positrón con un electrón del cuerpo del animal de experimentación. 

Producción de radioisótopos PET

Los emisores de positrones más frecuentemente usados en Radiofarmacia y Medicina Nuclear son el 18F, 11C, 13N y 15O, destacando las aplicaciones del 18F por encima del resto (18F-Fluorodeoxiglucosa, FDG, es el radiofármaco más utilizado en clínica); no obstante, debido a sus cortos períodos de semidesintegración y a la necesidad de producirlos en un ciclotrón (un tipo de acelerador circular de partículas) su uso es limitado. El período de semidesintegración (T1/2) es el intervalo de tiempo que transcurre para que un determinado número de átomos de un radionucleido se reduzca a la mitad; en el caso de los emisores de positrones (radionucleidos PET) antes mencionados, el valor de T1/2 suele ser de minutos/horas. En estos últimos años también se están comenzando a utilizar otros radionucleidos PET con un período de semidesintegración mayor (del orden de horas/días) tales como 124I, 89Zr y 64Cu.

Una línea de I+D prioritaria para el CIEMAT es el desarrollo de aceleradores para uso en aplicaciones civiles; en este marco, el CIEMAT ha participado en un proyecto nacional denominado AMIT (Tecnologías de Imagen Molecular Avanzada) con el fin de estudiar la viabilidad tecnológica de un miniciclotrón superconductor de última generación para la producción de radiofármacos a bajo coste y reducidos requerimientos de instalación. Dicho ciclotrón se instalará en los laboratorios (Instalación Radiactiva IR-08) donde la Unidad de Aplicaciones Biomédicas y Farmacocinética desarrolla sus actividades y, en un futuro cercano, podrá producir 11C y 18F necesarios para la síntesis de radiofármacos de gran interés en investigación biomédica.

Un método alternativo de producción muy atractivo sobre todo desde el punto de vista de satisfacer la demanda a laboratorios-PET que no dispongan de acceso a un ciclotrón es a partir de generadores radioisotópicos. Los generadores de radionucleidos son dispositivos que contienen un radionucleido (denominado "padre") que en su desintegración origina un radionucleido ("hijo") con un período de semidesintegración corto. Este es el caso de la obtención de 68Ga a partir de un generador de 68Ge/68Ga, radioisótopo que en estos últimos años está teniendo un gran auge en Medicina Nuclear. La Unidad de Aplicaciones Biomédicas y Farmacocinética es pionera en España en la utilización de un generador comercial de 68Ge/68Ga y en el posterior marcaje de diferentes moléculas orgánicas con 68Ga; en estos últimos años ha desarrollado su propio generador de 68Ge/68Ga. Por otra parte, actualmente se encuentra trabajando en el desarrollo de un generador de 44Ti/44Sc; el isótopo 44Sc, con un período de semidesintegración mayor al del 68Ga (3,97 horas frente a 68 minutos, respectivamente), permite utilizar radiotrazadores para visualizar procesos hasta un día después de la administración del radiotrazador.

 

Generador de 68Ge/68Ga

Marcaje de moléculas con radioisótopos

Para el marcaje de diferentes compuestos como pequeñas moléculas, polímeros, péptidos, proteínas, oligonucleótidos, etc., se utilizan radioisótopos (14C, 125I, 99mTc, 111In, 32P, etc.) que se adquieren de diferentes casas comerciales o precursores ya marcados y, para el caso de emisores de positrones, radioisótopos que se obtienen de generadores (como 68Ge/68Ga) o de un ciclotrón (tal como 89Zr).

La Unidad tiene experiencia en la síntesis de fármacos con precursores marcados con 14C, en la iodación de proteínas con 125I, en la fosforilación de ácidos nucleicos con 32P, etc. Aunque el personal de la Unidad realiza el marcaje de los diferentes compuestos en estudio, en algunas ocasiones es posible que personal de las instituciones y/o empresas con las que se colabora puedan utilizar las infraestructuras que dispone el CIEMAT para realizar el marcaje contando con el apoyo técnico y asesoramiento científico por parte de la propia Unidad de Aplicaciones Biomédicas y Farmacocinética.

Como ya se comentó anteriormente, la Unidad es pionera en España en el marcaje de diferentes moléculas con el emisor PET 68Ga. Entre los compuestos marcados con ese radionucleido caben destacar:

  • Péptidos conjugados con DOTA (quelante bifuncional) tales como 
    • Análogos de la hormona estimulante de melanocitos (NAPamide) para el diagnóstico de melanomas, en colaboración con el Grupo de Melanoma del Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (Madrid)
    • Diferentes análogos de somatostatina (DOTATATE, DOTATOC, DOTANOC) para el diagnóstico de tumores de origen neuroendocrino, en colaboración con la Unidad de Imagen Molecular del Centro de investigaciones Médico Sanitarias (Málaga) así como con el Laboratorio de Imagen Médica del Hospital General Universitario Gregorio Marañón (Madrid).
  • Polímeros conjugados con DOTA, en colaboración con el Grupo de Polímeros Terapéuticos del Centro de Investigación Príncipe Felipe (Valencia).
  • Bifosfonatos, como EDTMP y BPAMD. 

Una vez obtenido el compuesto marcado, se calcula la actividad específica del producto y se determina su pureza radioquímica y radionucleídica.

Determinación de la pureza radioquímica de [68Ga]-DOTA-NAPamide por HPLC

 

Estudios "in vitro" con radioisótopos

La Unidad realiza estudios de saturación, unión competitiva e internalización de radioligandos en líneas celulares, así como la determinación de cualquier actividad biológica de interés en presencia del compuesto marcado; estos estudios permiten evaluar si la molécula marcada es viable para realizar estudios "in vivo" y/o "ex vivo".

Ensayos de unión de análogos de la hormona estimulante de melanocitos a células de melanoma

También se realizan diferentes ensayos:

  • Marcaje de células con 111In-oxina y [18F]-FDG para su seguimiento "in vivo".
  • Estudios de proliferación celular con [3H]-Timidina, y posterior cuantificación de la actividad incorporada mediante espectrometría de centelleo líquido.
  • Estudios de estabilidad en plasma/suero de los compuestos marcados así como estudios de unión a proteínas plasmáticas. 

Imagen molecular mediante PET/CT

La Unidad de Aplicaciones Biomédicas y Farmacocinética también es pionera en España en la utilización del radioisótopo PET 89Zr en el diagnóstico por imagen denominado Inmuno-Tomografía por Emisión de Positrones (Inmuno-PET) en la cual se combina la alta resolución y la capacidad cuantitativa del PET con la especificidad y selectividad de los anticuerpos monoclonales frente a una proteína de expresión exclusiva o mayoritaria en la superficie de la célula tumoral. Esta combinación hace que el Inmuno-PET sea comparable a realizar una inmunohistoquímica "in vivo", integrada, cuantificable, en tres dimensiones y de cuerpo completo permitiendo el diagnóstico y monitorización de los pacientes a lo largo del tiempo de una forma no invasiva. En este ámbito, la Unidad ha comenzado a colaborar con el Radiopharmaceutical Chemistry Laboratory del Boston Children Hospital (Massachussets, EEUU) y el Grupo de Química Organometálica y Aplicada de la Universidad Rey Juan Carlos, en el marco del Consorcio "Madrid+Visión", así como con el Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (Madrid).

La imagen molecular se define como la visualización, caracterización y medida de los procesos biológicos a nivel molecular y celular en el ser humano y otros organismos vivos. La Unidad realiza estudios de imagen molecular con radiotrazadores en animales de experimentación, fundamentalmente roedores (ratas y ratones); así, una vez administrada la molécula marcada en un animal, se procede a detectar y visualizar el radioisótopo de forma "in vivo" o "ex vivo". Para ello, se utilizan dos técnicas:

  • Imagen por tomografía por emisión de positrones y tomografía computerizada (PET/CT). Se dispone de dos tomógrafos en los cuales se introduce el animal anestesiado (por inhalación con isofluorano) y se realiza la toma de imágenes para ver la evolución espacial y temporal de la molécula marcada. La PET es actualmente la técnica "in vivo" mas potente para monitorizar diversos procesos biológicos en animales de experimentación ya que permite monitorizar de forma no invasiva determinadas funciones celulares (actividad metabólica, unión específica de radioligandos, hipoxia, proliferación celular, etc.), además de permitir realizar estudios longitudinales. Es una modalidad de imagen ampliamente utilizada en oncología para estadiaje, monitorización de eficacia del tratamiento y seguimiento de las recurrencias de un tumor dada la posibilidad que ofrece de una evaluación cuantitativa funcional a nivel molecular in vivo y de su alta sensibilidad y resolución en comparación con otros escáneres, lo que permite la detección de tumores muy pequeños. Otras aplicaciones de la PET son en el campo de la neurología y la cardiología. La mayoría de los estudios se realizan con el radiofármaco más convencional, la 18F-fluorodeoxiglucosa (FDG), aunque también se realizan estudios PET con otros radiotrazadores (moléculas marcadas con 68Ga, 18F, 11C, etc.)  En determinados casos, como sucede con el equipo PET/CT, la obtención de imágenes anatómicas del animal (mediante rayos X) permite la fusión con las imágenes funcionales con el fin de localizar con gran precisión el lugar donde se encuentra la actividad. Esta tecnología también permite determinar la eficacia terapéutica de diferentes fármacos ya que permite valorar tanto su farmacocinética como su farmacodinamia. Entre las actividades realizadas, caben destacar:
  • Detección de melanomas y tumores neuroendocrinos en ratones xenograft (ratones inmunodeprimidos a los cuales se les ha inoculado células tumorales) mediante PET con [68Ga]-DOTA-péptidos, en colaboración con los grupos de investigación mencionados anteriormente.

Detección de tumor primario y metástasis de melanoma mediante PET/CT en ratones xenograft

  • Detección de diferentes tipos de cáncer (pulmón, cavidad oral, etc.) en ratones modificados genéticamente mediante PET con [18F]-FDG, en colaboración con la Unidad de Oncología Molecular del CIEMAT


Detección de tumores mediante PET en la cavidad oral de ratones que ha sido modificados genéticamente (Cancer Res. 2009 February 1; 69(3): 1099-1108)

Detección de tumores en pulmón  mediante CT

  • Detección de tumores de vejiga en ratones modificados genéticamente mediante CT con agentes de contraste, en colaboración con la Unidad de Oncología Molecular del CIEMAT

Detección de tumor en vegija de ratón mediante CT con un agente de contraste

Visualización del corazón de rata con [18F]-FDG en un micro PET/CT (Argus, Sedecal)

Autoradiografía cuantitativa de animal completo (QWBA). La autorradiografía (localización y registro de un radionucleido dentro de un espécimen sólido) en cortes de animal completo, permite la detección y cuantificación del radionucleido de interés en diferentes órganos/tejidos del organismo. Una vez congelado el animal, se procede a realizar cortes sagitales de 25-100 µm de espesor en un criomicrotomo; las secciones se liofilizan de forma que puedan ser fácilmente manipuladas a temperatura ambiente, y se ponen en contacto con una pantalla de fósforo para obtener imágenes digitalizadas tras estimular la pantalla con una haz fino de láser. Entre las actividades realizadas, caben destacar: Mientras que ambas técnicas permiten la cuantificación del radiotrazador, la PET/CT presenta la ventaja que permite realizar estudios longitudinales, es decir, el análisis tomográfico en el mismo animal a lo largo del tiempo. Por otra parte, la QWBA tiene una resolución mayor que la PET (del orden de micras frente a los 1-2 mm de la PET), aunque sólo permite realizar el estudio una vez en el mismo animal.

  1. Biodistribución de fármacos marcados con 14C en rata
  2. Biodistribución de 125I-BMP en la rata, en colaboración con el Grupo de Ingeniería de Tejidos de la Universidad Complutense de Madrid
  3. Localización de [32P]-BO-110, fármaco para el tratamiento del cáncer desarrollado por Bioncotech Therapeutics y que se encuentra en fase preclínica.

Corte sagital de cuerpo entero de una rata en un criomicrotomo Leika

 

Estudios ADME con moléculas marcadas

El desarrollo de un nuevo medicamento es un proceso largo y costoso cuyo objeto es demostrar en distintas fases (descubrimiento, preclínica y clínica), que el nuevo fármaco reúne los requisitos de eficacia, seguridad y calidad exigidos para su comercialización y administración al ser humano. El desarrollo preclínico de un medicamento hace referencia al conjunto de estudios de eficacia y seguridad del principio activo que se deben realizar en sistemas biológicos diferentes al ser humano (animales de experimentación y sistemas "in vitro"). Cada fármaco particular necesita su propio desarrollo preclínico debiendo tenerse en cuenta diversos factores: tipo de compuesto, mecanismo de acción e indicaciones clínicas.

En todo desarrollo preclínico es imprescindible realizar un estudio farmacocinético del fármaco con animales de experimentación. Un estudio típico supone la administración de una cantidad fija del compuesto marcado con un radioisótopo al animal por diferentes vías (intravenosa y oral, habitualmente) y la recogida de muestras de sangre y excretas (orina y heces) a diferentes tiempos después de la administración. En algunos otros casos también se determina la radiactividad en los diferentes órganos y tejidos del organismo a diferentes tiempos post-administración. El disponer del fármaco marcado con un radioisótopo permite realizar balance de masas, biodistribución en órganos/tejidos, estimar la biodisponibilidad del compuesto, perfil metabólico, etc. La biodistribución también se realiza habitualmente mediante QWBA.

Por último, la Unidad realiza el análisis de los datos mediante los programas informáticos habituales (WinNonlin, ADAPT II, TopFit, etc.) con el fin de estimar los parámetros farmacocinéticos del compuesto marcado.

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El CIEMAT es el único centro público de I+D que realiza estudios ADME (absorción, distribución, metabolismo y excreción) de moléculas marcadas en animales de experimentación desde hace más de treinta años.